什么是外泌体？

外泌体天然存在于体液中，是活细胞分泌的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。

外泌体直径在40nm~160nm,平均直径为100nm左右。外泌体虽小，但具有和细胞类似的拓扑结构，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等物质。同时，关于外泌体产生的生物学意义和功能还存在很多未知的奥秘值得探索和研究。

外泌体的提取

想要研究好外泌体，首先是要获得高纯度的外泌体。外泌体的提取多采用超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、免疫磁珠法等方式。超速离心法是常用的外泌体纯化手段，目前已发表文献引用较多的方法，作为外泌体提取的金标准，适用于大体积样本。密度梯度离心是将超速离心和蔗糖密度梯度离心相结合，可清除由蛋白质等造成的干扰，得到的外泌体纯度更高，但其步骤也相对繁琐。超滤法是通过离心将溶剂和小分子物质过滤到膜的另一侧，将外泌体截留在超滤膜上。超滤法的操作相对简单，但由于超滤膜的粘附性，可能会造成部分外泌体的损失，影响得率。由于外泌体表面有许多标志蛋白，如CD63、CD81等， 因此免疫磁珠法是利用将抗体固定在磁珠上，相应抗体与蛋白质间的特异性作用，即可实现对外泌体的特异性富集。免疫磁珠法成本较高，不适合处理大量样本，但其优势在于操作简单，获取的外泌体完整性和纯度高。

外泌体的鉴定

虽然如上所述，目前外泌体的分离方法很多，但是现有的这些分离方法提取的外泌体都难以做到非常高纯度，多多少少都会残留有非外泌体成分的杂质。比如超速离心和密度梯度离心都不能很好地去除血清中低密度脂蛋白颗粒，因此需要通过多种实验来鉴定和评估外泌体样本的纯度和完整性。国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 提议，对于分离获得的外泌体需要从三个层面进行鉴定：

1 用透射电镜（TEM）进行外泌体形态鉴定

电镜具有较高的分辨率，可以直接观察到样品中外泌体的形态，因此可以用于鉴定外泌体的存在和完整性，但是电镜只能展示局部景象，不能反映样品中的外泌体数量。Scilia外泌体团队具有丰富的项目经验，已成功从各类样本，如牛奶，间充质干细胞，293细胞系，NK细胞，T细胞中提取纯化外泌体。下图一展示了Scilia外泌体团队从牛奶样本中提取的外泌体在TEM下的典型形态：

图一

2 用 NTA 检测外泌体粒径及浓度

纳米颗粒跟踪分析技术NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) 是一种测算粒子群体直径分布和粒子数量的计算方法，它通过光学原理感知粒子的存在，可快速准确地分析外泌体的粒径分布及浓度。上述的电镜可以观察外泌体的形态学特征，但依旧不知道样品中外泌体的数量，通过NTA测算粒子数目，统计直径分布以确认是否符合外泌体的定义，在粒子群体层面为外泌体鉴定提供有力证据。下图二是Scilia外泌体团队用NTA分析牛奶样本提取的外泌体粒径：

图二

3 用WB 检测外泌体标志蛋白表达情况

WB可以鉴定外泌体中存在的特定蛋白，WB检测外泌体标志蛋白可以说明外泌体成分的存在。外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族 (CD63/CD81/CD9)、热休克蛋白家族 (HSP60/HSP70/HSP90) 和一些细胞特异性蛋白。其中CD63、CD81和CD9是常用到的外泌体标志物。

通过上述三个实验，即电镜看到经典结构，WB检测到外泌体标志物的富集，NTA测算直径分布符合外泌体定义，可以确认外泌体的存在、完整性和数量，从而帮助研究者确认成功分离纯化出了外泌体。

外泌体这种由细胞分泌的天然囊泡，由于具有其固有特性和优势，受到科研界和企业的广泛关注。外泌体在医疗领域有着巨大应用前景，主要包括在诊断，治疗和药物递送这三个方面。在诊断方面，使用体液标本检测外泌体标志物，从而可以获取疾病相关信息的诊断，比如肿瘤早期诊断、疗效的预后评估等。在治疗方面，对外泌体有较多摄取的脏器，外泌体在这些相关疾病中具有治疗作用。在药物递送方面，外泌体已经成为除了病毒载体，脂质纳米颗粒等递送方法之外，被国内外许多药物研发企业争相布局的药物递送方式，已有研究将抗炎剂姜黄素、抗癌剂阿霉素和紫杉醇等装载到外泌体囊泡中用于相应疾病的治疗。随着对外泌体研究更加深入，技术更加成熟，相信外泌体在医疗领域的作用将越发重大。

Scilia在外泌体领域进行了布局，拥有系统性服务优势，可以实现从外泌体提取鉴定，外泌体标记，外泌体组学研究(包括高通量测序和蛋白质谱)和外泌体功能验证的“一站式服务”。