腺病毒载体ADV 丨基因载体丨技术服务 - 北京镁伽科技有限公司

腺病毒载体ADV

常用的疫苗载体

腺病毒（Adenovirus，ADV）是直径约为90-100nm、无包膜（无外部脂质双层）的病毒，有一个二十面体核衣壳，包含一个dsDNA基因组。能够携带大片段外源DNA（~7-8kb的容量）、感染分裂细胞和非分裂细胞、诱导体液和细胞免疫应答（这对于疫苗开发是有益的）、表现出较高效率的转导和高水平的转基因表达、不整合细胞DNA（在细胞内保持dsDNA游离体）。这些特性使腺病毒作为用于基因治疗的转基因载体、疫苗载体和溶瘤病毒疗法中使用的载体。Scilia具有专有技术，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺病毒包装工艺水平。

腺病毒ADV包装生产流程

步骤	描述	时间
病毒感染细胞	我们常规使用的第一代腺病毒包装系统包括1个含有缺失了E1/E3基因的腺病毒基因组序列的转移质粒（Transfer plasmid）和1个表达 E1基因的包装细胞（adenoviral E1-expressing cell line），包装流程是通过内切酶Pac将携带目的基因（Gene of Interest，称 GOI）的转移质粒线性化。线性化的质粒DNA随后转染到包装细胞中，E1基因的表达产物激活转移质粒上的腺病毒基因的表达（E3 基因的缺失不影响腺病毒的包装），产生重组腺病毒颗粒。此时生产出来的为粗制的腺病毒。	第1-6天
扩增	粗制的腺病毒再次转导到在包装细胞中进行扩增。	第7天
浓缩与纯化	对于非纯化的腺病毒，腺病毒可以被细胞直接分泌到培养基中，然后进行收集。对于超纯化腺病毒，则还需要进一步的氯化铯（CsCl）密度梯度离心进一步纯化和浓缩。	第24天
质检	对于每一个我们生产的腺病毒，质量控制均包括基于免疫组化（IHC）的滴度测定（Titer determination）、微生物（细菌和真菌）检测（Bioburden test）和支原体检测（Mycoplasma test）。若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化腺病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）	第28天及以后

ADV病毒包装交付清单和服务周期

Scilia提供腺病毒Admax系统和腺病毒adEasy系统包装服务。Admax系统的病毒感染是通过病毒颗粒表面的纤突（Fiber）与细胞表面受体CAR（Coxsackie virus and adenovirus receptor）特异性结合而介导的并不是所有细胞都高表达CAR，Admax系统的病毒在某些不表达或者低表达CAR的细胞种类上的应用受限；adEasy系统可以很好的补充这一局限性，更好的为客户服务。

定制内容	交付周期	交付清单	常规规格
ADV小量定制（总量1×10¹⁰PFU，滴度≥1×10¹⁰PFU/mL）	4周左右	ADV病毒和质检报告	50μl/管
ADV中量定制（总量1×10¹⁰PFU，滴度≥1×10¹¹PFU/mL）	4周左右	ADV病毒和质检报告	50μl/管
ADV大量定制（总量1×10¹⁰PFU，滴度≥1×10¹¹PFU/mL）	6周左右	ADV病毒和质检报告	50μl/管

运输与存储

Scilia纯化腺病毒存储于PBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到腺病毒后，立即放置于-80℃，可保存约一年。若放置于-20℃，则可保存2-3周。融解后的腺病毒可在4℃保存1-2周。虽然腺病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，因为这会导致腺病毒滴度显著下降。

三种工具病毒ADV & LV & AAV的特点比较

病毒表达系统	腺病毒ADV	腺相关病毒载体AAV	慢病毒LV
病毒基因组	dsDNA	ssDNA	ssRNA
基因组大小	36kb左右	4.8kb左右	9kb左右
病毒颗粒直径	90-100nm	20-30nm	80-100nm
包装/克隆容量	≤7.5kb	≤3kb	≤4kb
病毒滴度	10¹⁰-10¹¹pfu/ml	10¹²-10¹⁴vg/ml	10⁸-10⁹TU/ml
感染的细胞类型	分裂和非分裂细胞	分裂不旺盛细胞	分裂和非分裂细胞
表达丰度	高水平瞬时表达	高水平表达	中到高水平表达
表达时效性	短暂（1-2天开始表达，持续≤2-4周）	潜在的长久（7-14天开始表达，持续3-6个月）	长久（2-4天开始表达，持续≥6个月）
外源基因整合至宿主基因组	非整合	非整合	整合
免疫原性	较高	超低	低
应用	细胞/动物较大基因过表达	动物实验常用载体；基因治疗药物载体	细胞实验常用载体；CAR-T治疗的递送载体
安全性	BSL-2	BSL-1	BSL-2

常见问题解答

1、ADV使用安全吗？

所有与腺病毒有关的工作都应在BSL-2设备中进行。我们所有的腺病毒包装服务使用的是复制缺陷（E1/E3基因删除）5型人源腺病毒（Ad5）。尽管重组腺病毒不能复制，但通过病毒载体和表达病毒复制必需基因（E1）的包装细胞系之间的仍有概率，产生复制能力强的腺病毒。为了避免这种情况，请不要连续扩增腺病毒，因为产生具有复制能力的腺病毒的几率会随着每一轮的扩增而增加。

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