慢病毒载体LV 丨基因载体丨技术服务 - 北京镁伽科技有限公司

慢病毒载体LV

细胞功能实验常用载体

慢病毒载体（Lentivirus，LV）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂，是非常有效的基因传递方法之一。

慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。

慢病毒LV包装生产流程

步骤	描述	时间
病毒载体共转	我们常规使用的第二代慢病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个膜蛋白表达质粒（Envelope plasmid）、1个包装质粒（Packaging plasmids），将这些质粒共转染包装细胞。1个包装质粒分别为Gag/Pol表达质粒。	第1天
收集细胞上清	在细胞里，转移质粒转录出携带目的基因（Gene of Interest，简称GOI）的HIVRNA 基因组，与包装质粒表达出的衣壳结构蛋白、酶、调控蛋白组装成病毒颗粒后，转运到细胞膜内侧，形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白质粒表达的VSV-G膜蛋白锚定在细胞膜上，随着病毒成熟，与细胞膜一起成为了病毒的膜。细胞短暂孵育后，收集上清，离心去除细胞碎片并过滤。	第3天
浓缩并纯化	PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化慢病毒（体内应用级别），采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。	第4天
质检	对病毒进行滴度测定（Titer determination）、微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化慢病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）。	第5天及以后

慢病毒包装交付清单和服务周期

● VSV-G假病毒化的第三代慢病毒（默认）
● VSV-G假病毒化的第二代慢病毒
● 使用其他膜蛋白进行假病毒化的慢病毒（如使用冠状病毒刺突蛋白）
● 无膜蛋白的表面光秃的慢病毒（可用于转导时的阴性对照）

定制内容	交付周期	交付清单	常规规格
LV 小量定制（总量1×10⁸TU，滴度≥1×10⁸TU/mL）	3周左右	LV病毒和质检报告	50μl/管
LV 中量定制（总量1×10⁸TU，滴度≥1×10⁸TU/mL）	3周左右	LV病毒和质检报告	50μl/管
LV 大量定制（总量1×10⁸TU，滴度≥1×10⁸TU/mL）	4周左右	LV病毒和质检报告	50μl/管

*表中时间为平均交付时间，最终以项目评估时间为准。赠送50μl对照病毒（一般为空载或带荧光标签病毒，其他特殊对照需要定制）

运输与存储

Scilia的慢病毒存储在PBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到慢病毒后，立即放置于-80℃，长期贮存至少6个月。慢病毒的保质期约为一年。请避免反复冻融，因为这会导致慢病毒滴度大幅下降。

三种工具病毒ADV & LV & AAV的特点比较

病毒表达系统	腺病毒ADV	腺相关病毒载体AAV	慢病毒LV
病毒基因组	dsDNA	ssDNA	ssRNA
基因组大小	36kb左右	4.8kb左右	9kb左右
病毒颗粒直径	90-100nm	20-30nm	80-100nm
包装/克隆容量	≤7.5kb	≤3kb	≤4kb
病毒滴度	10¹⁰-10¹¹pfu/ml	10¹²-10¹⁴vg/ml	10⁸-10⁹TU/ml
感染的细胞类型	分裂和非分裂细胞	分裂不旺盛细胞	分裂和非分裂细胞
表达丰度	高水平瞬时表达	高水平表达	中到高水平表达
表达时效性	短暂（1-2天开始表达，持续≤2-4周）	潜在的长久（7-14天开始表达，持续3-6个月）	长久（2-4天开始表达，持续≥6个月）
外源基因整合至宿主基因组	非整合	非整合	整合
免疫原性	较高	超低	低
应用	细胞/动物较大基因过表达	动物实验常用载体；基因治疗药物载体	细胞实验常用载体；CAR-T治疗的递送载体
安全性	BSL-2	BSL-1	BSL-2

常见问题解答

1、慢病毒使用安全吗？

所有与慢病毒有关的工作都应在BSL-2设施中进行，这是大多数细胞培养设施的生物安全水平。对于我们所有的慢病毒包装服务，我们使用复制缺陷型慢病毒，这种病毒不能产生病毒颗粒，除非存在包装和包膜质粒。请注意，尽管重组慢病毒无法复制，但如果在包装、包膜和转移质粒之间发生重组，将产生能够复制的病毒颗粒，通常概率非常小。
2、怎样寄送质粒？

TE缓冲液中的质粒可以在室温下运送，建议顺丰快递。
3、需要提供多少质粒？

通常需要提供不少于500ng的质粒（如需赶周期请提供包装用量的质粒一般不少于500μg）
4、包装质粒需要提供哪些信息?

质粒名称，质粒DNA浓度，LTRs（包括LTRs）之间的大小，抗性，质粒序列或者图谱（如果有）

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